Ressource partagée en génomique (RSG)

Illumina NovaSeq 6000

Illumina NextSeq 500

Illumina MiSeq

Illumina iScan

10x Genomics Chromium X et Chromium Controller

Autres équipements

Extraction d'acide nucléique et contrôle qualité

• Extraction d'ADN/ARN
  • Tissus, FFPE, cellules, sang, plasma (cfDNA), salive, écouvillons buccaux, etc.
• La microbiome
  • Fèces, tissus et salive

Bioanalyseur

TapeStation

Qubit

SpectraMax

Covaris

Séquençage

• Séquençage de nouvelle génération
  • ARN-séq
  • Génome entier (WGS)
  • Exome entier (WES)
  • Méthylation (WGBS, RRBS)
  • Métagénome (16s, méta-GEX, méta-génome)
  • EpiGen : ChIP, ATAC, découpe et exécution
• Séquençage de Sanger
  • Séquençage de Sanger
  • Analyse de fragments

NovaSeq

IPS 3500

SuivantSeq

MiSeq

Profilage unicellulaire et spatial

• Transcriptomique unicellulaire
  • Profilage de l'expression génique
  • Dépistage CRISPR
  • Gène et protéines de surface cellulaire
  • Profilage immunitaire
• Epigénomique unicellulaire
  • Accessibilité de la chromatine (ATAC-seq)
  • Multiome - GEX+ATAC-seq
• Transcriptomique spatiale
  • 10x Visium

Chrome X

10X Visium

Technologies complémentaires

• Illumina iScan
  • Tableaux de SNP
  • Réseaux de méthylation
• Compteur n de nanochaînes
  • Panels d'expression génétique
  • CNV
• Pcr en temps réel
  • TaqMan : GEX, SNP
  • SYBR-GEX

est possible

nCompteur

QuantStudio 6 Flex

La ressource partagée de génomique prépare l’ARN et l’ADN à partir de divers types d’échantillons, en utilisant plusieurs protocoles d’extraction en fonction de la taille de l’échantillon et de l’application en aval.

• ADN (cellules, tissus, sang, FFPE) : Qiagen DNeasy, PAXgene Blood DNA, Covaris truXTRAC FFPE total NA
• ARN (cellules, tissus, sang, FFPE) : TRIzol, Qiagen miRNeasy, PAXgene Blood miRNA, Covaris truXTRAC FFPE total NA
• Enrichi en miRNA : Qiagen miRNeasy
• Traitement d'échantillons pour les analyses du microbiome : DNeasy PowerSoil Pro, ZymoBIOMICS DNA

Contrôle de la qualité des acides nucléiques

• Lecteur de plaques fluorescentes Qubit et SpectraMax : quantification picogreen, ribogreen
• Bioanalyzer 2100 : puces à ARN et à ADN
• Station de mesure de bande Agilent 4200

Exemples d'exigences

• Culot cellulaire : 250,000 1 à XNUMX million de cellules. Culot cellulaire congelé ou frais
• Tissu : 10 à 25 mg de tissu congelé
• Sang : Tubes Paxgene pour ARN, 300 ul de sang total pour extraction au format plaque
• FFPE : 10 lames ou boucles, épaisseur 5 à 10 um

Contactez Prashant Singh au 716-845-3869, Prashant.Singh@RoswellPark.org pour des besoins d'échantillons spécifiques aux projets.

Le GSR propose une gamme complète de services NGS, notamment le séquençage du génome entier (WGS), le séquençage de l'exome entier (WES), le transcriptome entier (ARN-seq et petit ARN-seq), le WGBis-seq (méthyl-seq), le ChIP-Seq, l'ATAC-seq et le séquençage ciblé de l'ADN. De plus, le GSR propose également le séquençage de cellules individuelles et la transcriptomique spatiale à l'aide des plateformes Genomics Chromium X 10x et Genomics Visium 10x, respectivement, qui permettent une analyse détaillée de l'hétérogénéité des tissus au niveau d'une cellule unique et d'un tissu entier. Le GSR abrite les séquenceurs Illumina NovaSeq 6000, NextSeq500 et MiSeq de pointe nécessaires à la réalisation de projets de séquençage de nouvelle génération (NGS). En outre, l'installation contient un robot cyclone pour l'automatisation de projets à grande échelle.

Génomique

Le séquençage de l'ADN génomique est utilisé pour interroger et identifier les mutations de l'ADN, les SNP, les variations du nombre de copies (CNV) et les variations structurelles (SV). Le GSR propose différents types de services de séquençage de l'ADN, notamment le séquençage du génome entier, le séquençage de l'exome entier et le séquençage ciblé.

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Transcriptomique

Le séquençage du transcriptome (RNA-seq) fournit une mesure complète des niveaux de transcrits et de leurs isoformes à un moment biologique donné et est utilisé pour identifier les gènes exprimés différemment entre différents échantillons. Le GSR fournit plusieurs types de services RNA-seq adaptés à différents types d'échantillons, d'entrées d'ARN, de qualité d'ARN et de différentes espèces d'ARN telles que l'ARNm, les petits ARN, les ARN non codants ou les microARN.

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Type de bibliothèque	Méthode/Kits de bibliothèque	Exemple d'entrée/qualité	Application
ARN-seq total	Kit HyperPrep KAPA RNA avec RiboErase (HMR). Épuisement ribosomique.	25 ng – 1 µg, RIN>4	Séquençage du transcriptome entier. Bibliothèque de brins. Analyse de l'expression génétique, détection de fusions de gènes, y compris les transcrits non codants, les isoformes et l'identification de nouveaux transcrits.
ARNm-seq	Kit HyperPrep d'ARNm KAPA. Enrichissement en poly(A)	50 ng – 1 µg, RIN>7	Séquençage du transcriptome entier. Bibliothèque de brins, analyse de l'expression génique des gènes codant pour des protéines et détection de fusions de gènes.
Transcriptome entier FFPE	ARN HS2 SureSelect XT	10 à 200 ng d'ARN total provenant d'échantillons FFPE intacts ou hautement fragmentés (DV200>20%)	Analyse de l'expression génétique par capture d'exons avec le kit SureSelect Human All Exon V8+UTR. Convient à l'ARN hautement dégradé tel que celui des échantillons FFPE.
Pico-entrée	Kit Takara/Clotech SMARTer Stranded Total RNA-Seq - Entrée Pico (épuisement du ribosome)	250 pg–10 ng, RIN>4	Séquençage du transcriptome entier avec des échantillons à faible entrée. Bibliothèque en mode Stranded.
Entrée ultra faible	Kit SMART-Seq v4 à très faible entrée (enrichissement en poly(A))	Jusqu'à 1,000 10 cellules ou 10 pg–7 ng d'ARN total, RIN>XNUMX	Séquençage du transcriptome entier avec des échantillons d'entrée ultra-faibles. Bibliothèque non-branchée.
Petit ARN	Kit SMARTer smRNA-Seq	1 ng–2 µg, RIN>7	Analyse de l'expression des petits ARN non codants (smRNA) y compris les microARN

Il est essentiel de traiter les échantillons d'ARN avec de la DNase pour les applications RNA-seq. L'évaluation qualitative des échantillons d'ARN est réalisée à l'aide d'Agilent Bioanalyzer ou TapeStation et les échantillons d'ARN avec RIN >7 sont considérés comme de haute qualité et adaptés à tous les tests. Les échantillons d'ARN dégradés peuvent être analysés (c.-à-d. tissus fixés à la paraffine ou au formol) avec une méthode appropriée. Les exemples ci-dessous montrent différents échantillons de qualité d'ARN. L'utilisation de mRNA-seq n'est pas recommandée pour les échantillons de qualité inférieure car elle entraînera un biais 3'.

Épigénomique

Les approches épigénomiques sont utilisées pour étudier les changements dans l'activité des gènes causés par des mécanismes autres que les changements de séquence d'ADN tels que la méthylation de l'ADN, la régulation des gènes par les petits ARN, les interactions ADN-protéines, la modification des histones, l'accessibilité de la chromatine, etc. Le GSR propose divers tests épigénomiques utilisant des plateformes NGS et de microarray.

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Métagénomique

La métagénomique permet de caractériser la composition et la variation de la communauté microbienne dans un échantillon donné. Le GSR offre un service complet de métagénomique, y compris l'extraction d'ADN et d'ARN et diverses approches NGS.

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Ces dernières années, le séquençage de cellules individuelles a apporté de nouvelles connaissances sur l'hétérogénéité du microenvironnement tissulaire et tumoral à une résolution de cellule unique. Ces connaissances ont permis d'identifier de nouveaux types de cellules et ont ouvert la voie à des interventions thérapeutiques innovantes. Le GSR fournit une application de séquençage de cellules individuelles à l'aide de la plateforme 10x Genomics Chromium X.

Applications monocellulaires prises en charge par le GSR

• Transcriptomique unicellulaire
  • Profil d'expression génétique (expression génétique 3' et 5')
  • Criblage de l'expression génétique par CRISPR
  • Gène et protéines de surface cellulaire
  • Profilage immunitaire et spécificité antigénique
• Epigénomique unicellulaire
  • Accessibilité de la chromatine (ATAC-seq)
  • Multiome : expression génétique + ATAC-seq

Des informations sur la préparation des échantillons à soumettre peuvent être trouvées ici trouvé ici.

Exigence d'échantillon :

• Les cellules doivent être dans une suspension cellulaire unique et exemptes de débris et d’agrégats cellulaires.
• La viabilité cellulaire doit être > 70 %, une viabilité inférieure peut produire des résultats compromis
• Le stock de cellules doit être compris entre 500 et 1200 1.5 cellules/ul dans des tubes Eppendorf de 30 ml, volume 50 à XNUMX ul
• Les cellules doivent être remises en suspension dans du PBS + 0.04 % de BSA ou dans un milieu complet,
• L'échantillon doit être livré sur glace avec le formulaire de soumission d'échantillon rempli avant 2 heures.
• Veuillez fournir des informations sur la récupération de cellules cibles souhaitée (100 à 20000 3 cellules/échantillon) et le type d'analyse (5'GEX, XNUMX'GEX, ATACseq, TCR/BCR)

Combien de cellules soumettre ?

La plateforme 10x a un taux de capture d'environ 60 %, donc si par exemple la récupération de cellules cibles souhaitée est de 10,000 16,000 cellules, alors 10 XNUMX cellules sont chargées dans le système. Le tableau fournit des informations sur le nombre de cellules requises pour différentes récupérations de cellules cibles. Nous avons également besoin de XNUMX ul de suspension cellulaire pour le contrôle qualité.

Un exemple pratique :

Concentration cellulaire : 600 cellules/ul

Récupération des cellules cibles : 5,000 XNUMX cellules

Dans ce cas, nous aurons besoin de 10 ul de suspension cellulaire pour le comptage et le contrôle qualité (6,000 13.8 cellules) et 8,280 ul de suspension cellulaire seront chargés dans le système Chromium (23.8 14,280 cellules). Nous aurons besoin d'un minimum de 50 ul de suspension cellulaire (30,000 XNUMX cellules). Nous demandons au moins le double de la quantité minimale requise pour nous assurer d'avoir suffisamment de cellules pour recharger en cas de problème avec l'analyse du chrome. Par exemple, dans ce cas, nous demanderons XNUMX ul de suspension cellulaire ou XNUMX XNUMX cellules.

Profilage spatial :

Le séquençage de cellules individuelles permet une analyse complète de l'hétérogénéité des tissus et l'identification des différents types de cellules. Cependant, les informations spatiales des cellules au sein du tissu sont perdues en raison de la dissociation tissulaire. Les approches de profilage spatial permettent d'analyser la relation entre les cellules et leur microenvironnement dans le contexte tissulaire. La transcriptomique spatiale est une méthode de profilage moléculaire révolutionnaire qui permet une compréhension approfondie du développement normal et de la pathologie des maladies en mesurant l'expression des gènes dans un contexte tissulaire. Le GSR a utilisé la plateforme 10x Genomics Visium pour effectuer une transcriptomique spatiale. La plateforme Visium peut être utilisée pour les échantillons de tissus frais congelés et FFPE.

Le Visium est un travail complexe impliquant l'expertise en génomique et en pathologie. Veuillez contacter le Dr Prashant Singh pour discuter des détails concernant les besoins en échantillons et la conception expérimentale.

La ressource partagée de génomique fournit des services de SNP, de variation du nombre de copies (CNV) et de méthylation de l'ADN à l'échelle du génome à l'aide de la technologie des microréseaux (également connue sous le nom de technologie BeadArray).

Réseaux de méthylation

Nous utilisons des matrices de méthylation pour les échantillons d’origine humaine et murine.

Réseau de méthylation humaine

L'analyse de la méthylation à l'échelle du génome à l'aide de la puce Infinium MethylationEPIC BeadChip d'Illumina nécessite que les échantillons soient analysés par lots de 16. Nous avons besoin de 1 ug d'ADN de poids moléculaire élevé (via la quantification picogreen) par échantillon.

La puce MethylationEpic BeadChip d'Illumina contient plus de 850 99 sites CpG hautement informatifs couvrant 95 % des gènes RefSeq et 5 % de tous les îlots CpG connus, ainsi que des sites d'amplification et d'autres catégories de contenu. La matrice comprend des sites CpG en dehors des îlots CpG, des sites méthylés non CpG, des sites différentiellement méthylés identifiés dans la tumeur par rapport à la normale, des activateurs FANTOM 90, de la chromatine ouverte et des activateurs ENCODE, des promoteurs miRNA et des sites hypersensibles à la DNase. La matrice MethylationEpic contient plus de 450 % des CpG sur l'Illumina Methylatio350,000 plus XNUMX XNUMX CpG supplémentaires dans les régions d'amplification.

Réseau de méthylation de souris

L'analyse de la méthylation du génome entier des échantillons de souris est réalisée à l'aide de la puce Infinium Mouse Methylation BeadChip. Cette matrice interroge plus de 285 24 sites de méthylation sélectionnés pour couvrir les îlots CpG, les sites de démarrage de la traduction, les activateurs, les loci imprimés et d'autres régions. Cette matrice nécessite que les échantillons soient traités par lots de 1. Nous avons besoin de XNUMX ug d'ADN de poids moléculaire élevé (via la quantification picogreen) par échantillon.

Tableaux de SNP

Le GSR fournit des analyses de génotypage globales, des services de variation du nombre de copies d'ADN (CNV) et de perte d'hétérozygotie (LOH) à l'aide des produits Illumina Infinium. Les puces BeadChips d'Illumina fournissent un large éventail de produits d'analyse d'ADN du génome entier pour prendre en charge une variété de modèles expérimentaux. Les chercheurs ont la possibilité d'utiliser des panels de 300,000 5,000,000 à près de XNUMX XNUMX XNUMX de marqueurs par échantillon, en fonction de leurs objectifs d'étude. Toutes les puces BeadChips fournissent un génotypage SNP puissant et intégré à l'échelle du génome, une détection LOH et CNV.

Exemples d'exigences

Nous demandons 1 ug d'ADN génomique de haute qualité pour les matrices Illumina. L'exigence d'entrée pour les matrices de méthylation est de 500 ng et de 200 ng pour les matrices SNP. La plupart des protocoles d'isolement d'ADN génomique standard produiront un ADN d'une pureté suffisamment élevée pour l'analyse par microarray. Il est fortement recommandé de vérifier l'ADN génomique pour détecter toute dégradation et contamination par l'ARN. Il est essentiel d'utiliser des quantités purifiées et précises d'ADN pour le marquage fluorescent. L'ADN dégradé provenant d'échantillons FFPE peut être utilisé avec les matrices Illumina après avoir effectué la restauration de l'ADN. Veuillez contacter Prashant Singh au 716-845-3869 pour plus de détails.

Avis de non-responsabilité concernant les données SNP

Ces analyses sont destinées uniquement à des fins de recherche. Les résultats fournis dans ce rapport ne sont pas certifiés par le Département de la Santé de l'État de New York et ne sont pas destinés à être utilisés dans le cadre de tests de diagnostic ou de traitement cliniques. En utilisant ces résultats d'analyse, l'utilisateur accepte que le Roswell Park Comprehensive Cancer Center ne soit pas responsable des réclamations ou des dommages de quelque nature que ce soit causés à un utilisateur de ces résultats d'analyse pour une décision ou une action prise sur la base des informations fournies dans les résultats, y compris tout dommage direct, indirect, spécial, accessoire ou consécutif lié à son utilisation.

Roswell Park ne donne aucune garantie, expresse ou implicite, quant à la qualité marchande ou à l'adéquation à un usage particulier des résultats d'analyse. Ces résultats d'analyse sont fournis « tels quels » et sans garantie que leur utilisation ne violera aucun brevet ou autre droit de propriété d'un tiers.

La ressource partagée de génomique fournit une analyse de l'expression génétique sur plusieurs plates-formes différentes en fonction de l'organisme, du matériel de départ et de la taille de votre projet.

Séquençage de l'ARN (RNA-Seq)

Le GSR utilise plusieurs types de méthodes de préparation de bibliothèques RNA-seq pour effectuer des analyses d'expression génique globale en fonction de l'échantillon et des exigences d'analyse. Plus de détails sont fournis dans la section NGS.

Expression du gène nCounter de NanoString

Le système d'analyse nCounter de NanoString utilise une technologie numérique pour mesurer directement et simultanément plusieurs cibles génomiques dans des échantillons de tissus, sans nécessiter d'amplification ou de préparation de bibliothèque. Le GSR utilise le système d'analyse nCounter pour l'analyse des panels de gènes NanoString, des panels de gènes personnalisés et de l'expression de microARN. Les panels d'expression génétique NanoString sont disponibles pour l'homme et la souris.

PCR quantitative en temps réel (qPCR)

Le GSR propose un service complet d'analyse qPCR à l'aide du système de PCR en temps réel QuantStudio 6 Flex. La qPCR est utilisée pour l'analyse de l'expression génique d'un petit nombre de gènes (1 à 20 gènes). Nous pouvons exécuter à la fois des tests TaqMan et SYBR green. La qPCR est utilisée pour l'analyse de l'expression de l'ARNm ainsi que des microARN.

Exemple d'exigence

En général, 100 ng à 1 µg d’ARN total sont nécessaires, selon le test.

Remarque : il est essentiel de traiter les échantillons d'ARN avec de la DNase pour les applications RNA-seq. L'évaluation qualitative des échantillons d'ARN est réalisée à l'aide d'Agilent Bioanalyzer ou de TapeStation et les échantillons d'ARN avec RIN > 7 sont considérés comme de haute qualité et adaptés à tous les tests. Les échantillons d'ARN dégradés peuvent être analysés (c.-à-d. tissus fixés à la paraffine ou au formol) avec NanoString et RNA-seq.

La ressource partagée de génomique offre un service complet de séquençage Sanger et d'analyse de fragments. Le GSR abrite deux analyseurs génétiques ABI 3500 pour le séquençage Sanger et l'analyse de fragments.

Commande en ligne

Toutes les commandes doivent être passées via le système LIMS. Grâce à notre système de commande en ligne, vous pourrez soumettre vos commandes par voie électronique et récupérer vos données de séquence une fois terminées.

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NOUS CONTACTER

Marlar de Khin
Ressource partagée sur la génomique
Laboratoire de séquençage d'ADN
Centre de génétique et de pharmacologie, L1-104
Centre de lutte contre le cancer de Roswell Park
Rues Elm et Carlton
Buffalo, NY 14263
E-mail : Khin.Marlar@RoswellPark.org
Téléphone : 716-845-8314
Fax: 716-845-1579

Lors de l'envoi d'échantillons par courrier, il est préférable de choisir une livraison le lendemain. Bien que les échantillons d'ADN soient stables à température ambiante, des séjours prolongés à ces températures peuvent entraîner une dégradation de l'ADN et une détérioration ultérieure de la qualité de la séquence. Vous trouverez ci-dessous des informations sur les amorces que nous fournissons.

Tables d'amorce

Grille tarifaire

Tous les tarifs pour les membres et non-membres du Roswell Park CCSG sont disponibles en contactant Prashant Singh au 716-845-3869 or Prashant.Singh@RoswellPark.org.

Mention légale concernant le séquençage de Sanger

Les services de séquençage d'ADN fournis par la ressource partagée génomique de Roswell Park sont destinés uniquement à des fins de recherche. Ces services de séquençage d'ADN ne sont pas destinés ni certifiés par le Département de la santé de l'État de New York pour une utilisation dans des tests de diagnostic clinique ou des traitements, y compris, mais sans s'y limiter, l'éducation des patients.

Le Roswell Park Comprehensive Cancer Center ne sera pas responsable des réclamations ou des dommages de quelque nature que ce soit causés à un utilisateur de ces services de séquençage d'ADN pour une décision ou une action prise sur la base des informations fournies dans le séquençage d'ADN. Ces dommages comprennent, sans limitation, les dommages directs, indirects, spéciaux, accessoires ou consécutifs.

La ressource partagée de génomique fournit un service d'authentification de lignées cellulaires humaines à l'aide du profilage de répétitions courtes en tandem (STR).

Information de Base:

Les lignées cellulaires sont des outils de recherche importants pour la recherche biomédicale fondamentale et préclinique. Cependant, la contamination et l'identification erronée des lignées cellulaires constituent un problème majeur conduisant à des résultats erronés et à une non-reproductibilité des données. Les changements récents apportés aux directives de soumission de subventions du NIH exigent que toutes les lignées cellulaires soient authentifiées par analyse chromosomique ou profilage STR.

Profilage STR

L'authentification des lignées cellulaires est réalisée à l'aide de loci STR qui sont également utilisés dans l'empreinte génétique. Les marqueurs STR sont des loci d'ADN polymorphes qui contiennent une séquence nucléotidique répétée et le nombre de répétitions varie pour chaque individu. La combinaison de répétitions est utilisée pour faire correspondre les lignées cellulaires à leur profil rapporté (ATCC, DSMZ, etc.).

Nous utilisons le kit d'amplification PCR AmpFlSTR Profiler d'Applied Biosystems qui amplifie 15 loci STR et le gène de l'amélogénine en une seule réaction de PCR multiplex. Les produits d'amplification sont marqués par fluorescence et analysés à l'aide du séquenceur ABI 3130xl. Chaque pic de l'électrophorégramme représente un allèle et en comparant les données de l'échantillon à une échelle allélique, le nombre d'unités de répétition est déterminé. Cette valeur numérique pour chaque répétition est ensuite comparée au profil STR de la lignée cellulaire rapporté dans les bases de données ATCC et DSMZ pour confirmer la lignée cellulaire.

Grille tarifaire

Tous les tarifs pour les membres et non-membres du Roswell Park CCSG sont disponibles en contactant Prashant Singh au 716-845-3869 or Prashant.Singh@RoswellPark.org.