Orientación genética y recursos compartidos transgénicos (GeTT)

Inyección transgénica (varios orígenes)

El Recurso Compartido de Orientación Genética y Transgénicos (GeTT) del Centro Oncológico Integral Roswell Park extraerá e inyectará ADN preparado y purificado por el investigador o el GeTT (según se elija) en los pronúcleos de los ovocitos. Los óvulos supervivientes se implantarán en hembras pseudopreñadas, y las crías que nazcan se someterán a una biopsia de cola para aislar el ADN y se identificarán mediante un crotal auricular. El GeTT garantiza la transferencia quirúrgica de al menos 100 óvulos o la producción de tres crías transgénicas (lo que ocurra primero).

Nota : No se garantiza la expresión de su gen.

Transgénicos lentivirales

Las inyecciones de constructos lentivirales se realizan a solicitud. El investigador deberá obtener la aprobación previa del Comité de Bioseguridad del Instituto para comenzar las inyecciones. Para obtener más información, comuníquese con Aimee Stablewski al 716-845-5843 o a Aimee.Stablewski@RoswellPark.org.

Tras recibir la construcción de ADN de su laboratorio, el Recurso Compartido de Orientación Genética y Transgénicos (GeTT) del Centro Oncológico Integral Roswell Park realizará una electroporación de su ADN en células madre embrionarias de ratón W4 (129S6/SVEvTac), G4 (129/B6) o JM8A3.N1 (C57BL/6Tac). Las colonias se seleccionarán con el fármaco adecuado, según su marcador de selección positivo. También se pueden seleccionar colonias negativamente para fines de enriquecimiento. Los métodos de selección deben discutirse con el recurso antes de la fecha de electroporación para preparar las células alimentadoras necesarias.

El recurso seleccionará y congelará ~240 colonias, de las cuales le entregaremos al laboratorio del investigador ~200 preparaciones de ADN. El investigador examinará estos clones mediante análisis Southern y/o PCR y notificará al recurso los positivos para recombinación homóloga. La instalación expandirá cinco de estos clones y le entregará ADN al investigador nuevamente para reconfirmar los positivos. Cuando se reconfirmen, el recurso puede comenzar con las microinyecciones de orientación genética para el laboratorio del investigador.

Todo el proceso de electroporación demora aproximadamente un mes y el recurso espera que el laboratorio del investigador realice las confirmaciones positivas de manera oportuna.

Para obtener un presupuesto específico para su proyecto, póngase en contacto con Aimee Stablewski al 716-845-5843 o a través del correo electrónico Aimee.Stablewski@RoswellPark.org .

Microinyección de blastocistos con células ES generadas internamente o por un colaborador

El recurso compartido de modificación genética y transgénica (GeTT) del Centro Oncológico Integral Roswell Park extraerá blastocistos de ratones C57BL/6 (actualmente ratones albinos C57BL/6 del Laboratorio Jackson) e inyectará la cantidad adecuada de células madre embrionarias por blastocisto (proporcionadas por el investigador o generadas en nuestras instalaciones). (Si no se generan en nuestro recurso, deberá enviar un informe de patología de micoplasma y una prueba IMPACT de IDEXX RADIL con su línea celular , o podemos enviar su línea celular para su análisis, lo que generará cargos adicionales).

Los blastocistos inyectados se implantarán luego en hembras pseudopreñadas. El GeTT garantiza que se inyectarán e implantarán con éxito al menos 20 blastocistos en ratones adoptivos o se producirán tres crías quiméricas, lo que ocurra primero.

Inyecciones de células madre embrionarias KOMP/EUCOMM

Es similar a la microinyección de blastocistos; sin embargo, lea este mensaje sobre las inyecciones de células madre embrionarias KOMP/EUCOMM.

Para obtener un presupuesto específico para su proyecto, póngase en contacto con Aimee Stablewski al 716-845-5843 o a través del correo electrónico Aimee.Stablewski@RoswellPark.org .

Embriones congelados o frescos

El recurso compartido de orientación genética y transgénesis (GeTT) del Roswell Park Comprehensive Cancer Center derivará cepas de embriones frescos o congelados a pedido del investigador.

El recurso también trabajará con los investigadores para derivar las líneas de las instalaciones sucias a las instalaciones limpias aquí en Roswell Park. En esta situación, será necesario hacer arreglos con el recurso sobre dónde se encuentran alojados actualmente los ratones y cómo el recurso recibirá los embriones para la transferencia.

Fertilización in vitro

Se crearán embriones y luego se los derivará como se indicó anteriormente. Consulte FIV para obtener más detalles.

Nota : Una vez realizadas las transferencias quirúrgicas de embriones lavados, se cobrarán a los investigadores los gastos diarios según la tarifa de GeTT.

Para obtener un presupuesto específico para su proyecto, póngase en contacto con Aimee Stablewski al 716-845-5843 o a través del correo electrónico Aimee.Stablewski@RoswellPark.org .

Criopreservación de esperma

Para realizar este servicio se necesitan dos ratones macho de entre 10 y 16 semanas de edad. Congelaremos 20 pajuelas de esperma y las almacenaremos en nitrógeno líquido. Tras la descongelación, se realizará una prueba de viabilidad y una fecundación in vitro (FIV) hasta la etapa de dos células en una de las pajuelas para determinar la tasa de fecundación.

La criopreservación de esperma presenta varias oportunidades:

• Reducir sustancialmente el número de ratones en la colonia de un investigador.
• El esperma obtenido de un solo macho puede dar lugar a un gran número de crías tras la FIV de ovocitos. Una FIV de cohorte grande puede proporcionar a un investigador una progenie de la misma edad y sexo, que a veces se necesitan para las cohortes experimentales, y puede ayudar a obtener la cantidad de ratones necesaria cuando se necesitan múltiples alelos en el ratón.

La desventaja de la criopreservación de espermatozoides es que se conserva el genoma monoploide. El servicio de criopreservación de espermatozoides no garantiza la recuperación de los nacidos vivos mediante FIV y, en el caso de algunas cepas, se requiere la ICSI para su recuperación. Antes de la criopreservación se analizarán el recuento, la motilidad y la morfología de los espermatozoides.

Criopreservación de embriones

Nuestro personal especializado determinará la cantidad de embriones a criopreservar y el procedimiento más eficiente para su recolección. Se realiza un control de calidad in vitro en cada lote de embriones para verificar el éxito de la criopreservación.

La recolección de embriones se puede realizar de dos maneras:

• Apareamiento tradicional, recolección y congelación:En concreto, los machos sementales se aparean semanalmente con donantes de óvulos por sesión de criopreservación para producir embriones para criopreservación. En promedio, se necesitan de dos a cuatro sesiones de recolección de embriones para congelar suficientes embriones para garantizar la recuperación de esta manera tradicional. Si se utilizan machos homocigotos, se necesitarán menos sesiones. Sin embargo, pueden ser necesarias más sesiones si la cepa de ratones tiene una baja tasa de superovulación, los machos sementales tienen baja fertilidad o los machos son demasiado viejos. Algunas cepas no se pueden criopreservar con éxito. El investigador es responsable de proporcionar todos los machos sementales, donantes de embriones y costos de viáticos para estos animales. Las hembras serán superovuladas por la instalación GeTT y se aparearán con los machos, y los embriones resultantes se recolectarán y criopreservarán. Este procedimiento se repetirá hasta que se criopreserva una cantidad suficiente de embriones. Los embriones se aíslan y criopreservan en pajuelas y se almacenan en nitrógeno líquido.
• FIV, recolección y congelación:Las hembras serán superovuladas por el GeTT y se crearán embriones mediante FIV con esperma congelado o fresco. Los embriones se criopreservarán en la etapa de 2 células. Este procedimiento se repetirá hasta que se criopreserva una cantidad suficiente de embriones. Por lo general, esto solo debería llevar una sesión, pero a veces se necesita una segunda. Los embriones se criopreservan en pajuelas y se almacenan en nitrógeno líquido.

El GeTT almacena embriones en dos tanques separados en Roswell Park en Buffalo, Nueva York.

Fertilización in vitro (FIV) en ratones

Este procedimiento permite expandir rápidamente líneas a partir de un solo macho portador del genotipo deseado o mantener cepas con baja eficiencia reproductiva. El Recurso Compartido de Orientación Genética y Transgénesis (GeTT) del Centro Oncológico Integral Roswell Park realizará la superovulación de donantes de óvulos por sesión. Realizaremos FIV con esperma de su macho y de donantes de óvulos.

Después de un cultivo durante la noche, los embriones de dos células se transferirán a hembras pseudopreñadas al día siguiente (a menos que se especifique que se congelarán). Todos los cachorros destetados se transferirán al investigador. Esperamos que el investigador genotipifique a los cachorros y determine qué cachorros tienen el genotipo deseado. Los resultados de la FIV varían según los antecedentes genéticos y la calidad de los machos individuales utilizados para la FIV. Por lo tanto, no podemos ofrecer una garantía de que un procedimiento de FIV determinado produzca una gran cantidad de cachorros.

El GeTT ofrece tres tamaños de FIV: pequeño, mediano y grande. Podemos producir hasta 100 o más animales a la vez, si es necesario.

El programa de Orientación Genética y Transgénesis (GeTT) compartido en el Centro Oncológico Integral Roswell Park preparará nuevas líneas de células madre embrionarias de ratón a partir de blastocistos o ratones proporcionados por los investigadores. Se emplean métodos estándar que emplean un medio con suero e inhibidor de MEK1. La tasa de éxito de este procedimiento es alta, siempre que se puedan obtener blastocistos de la cepa en cuestión. Las células madre embrionarias (CE) proporcionan un suministro inagotable de células para estudios in vitro, ya que no experimentan senescencia ni cesan la división como otros tipos celulares (p. ej., fibroblastos).

Se debe avisar con anticipación, preferiblemente cuando se obtengan las futuras donantes de blastocistos. La edad ideal para las donantes de blastocistos internas para la respuesta de superovulación es de 24 a 28 días para el fondo C57BL/6.

Para obtener un presupuesto específico para su proyecto, póngase en contacto con Aimee Stablewski al 716-845-5843 o a través del correo electrónico Aimee.Stablewski@RoswellPark.org .

El recurso compartido de orientación genética y transgénesis (GeTT) del Roswell Park Comprehensive Cancer Center puede proporcionar un recuento básico de cromosomas.

Las células madre embrionarias de ratón, ya sea de su laboratorio o compradas, se expandirán en nuestras instalaciones, se congelarán y se analizarán para detectar anomalías cromosómicas mediante cariotipo.

Para obtener un presupuesto específico para su proyecto, póngase en contacto con Aimee Stablewski al 716-845-5843 o a través del correo electrónico Aimee.Stablewski@RoswellPark.org .

En ciertos casos, las células madre embrionarias de ratón pueden ser aneuploides (con más o menos de 40 cromosomas). Las células ES aneuploides podrían generar quimeras; sin embargo, estas nunca se transmitirán a través de la línea germinal. Si se dispone de un clon de células ES aneuploides, es posible recuperarlo cultivándolo a baja densidad y seleccionando subclones diploides que se transmitan a través de la línea germinal.

Para obtener un presupuesto específico para su proyecto, póngase en contacto con Aimee Stablewski al 716-845-5843 o a través del correo electrónico Aimee.Stablewski@RoswellPark.org .

Proyectos CRISPR (300 pb-4.9 kb): modificaciones de RNP y AAV

El GeTT recolectará ovocitos fertilizados. Posteriormente, los embriones se infectarán con AAV (virus adenoasociado) que contendrá la modificación genética. A continuación, los embriones se electroporarán con un complejo de ARN/proteína (complejo RNP) con sumo cuidado para evitar su degradación.

El ADN y el ARN se preparan y purifican en el GeTT. Los óvulos supervivientes se implantarán en hembras pseudopreñadas, y a las crías nacidas se les realizará una biopsia de cola para el aislamiento de ADN y se las identificará mediante una marca auricular.

El GeTT recomienda encarecidamente realizar secuenciación de próxima generación (NGS) dirigida y secuenciación de lectura larga (LRS) en los animales F1 resultantes de inyecciones/electroporaciones CRISPR, ya que la concatenación siempre es una preocupación.

Proyectos CRISPR (Más de 4.9 kb)

El sistema GeTT recolectará e inyectará reactivos CRISPR en ovocitos fertilizados. El complejo ARN/proteína (denominado complejo RNP) junto con el ADN donante se inyectan simultáneamente en embriones unicelulares y se manipulan con sumo cuidado para evitar su degradación.

El ADN con brazos homólogos puede ser co-inyectado para dirigir la integración/recombinación homóloga a ese sitio. El ADN y el ARN son preparados y purificados por el GeTT. Los óvulos supervivientes serán implantados en hembras pseudopreñadas y las crías que nazcan serán sometidas a una biopsia de cola para aislar el ADN y también serán identificadas mediante una etiqueta en la oreja.

El GeTT recomienda encarecidamente realizar una secuenciación de próxima generación (NGS) dirigida a los animales fundadores y F1 resultantes de las inyecciones/electroporaciones CRISPR, ya que el mosaicismo siempre es una preocupación.

Proyectos CRISPR (Eliminaciones)

El GeTT ha creado con éxito ratones con deleciones genéticas de entre 1-10 kb, 30-90 kb y más de 100 kb.

• 1-10 kb: Se seleccionaron 9 loci (tasa de fundadores del 15-77%).
• 30-90 kb: Se seleccionaron 4 loci (tasa de fundadores del 15-50%).
• Deleción de más de 100 kb: Se analizaron 5 loci (tasa de fundadores del 15-35%).

** Todos los ratones caracterizados >95% han transmitido a través de la línea germinal

Modificación de líneas celulares mediante CRISPR

El Recurso Compartido de Orientación Genética y Transgénicos (GeTT) ofrece servicios a investigadores interesados ​​en la edición genómica de células cultivadas mediante CRISPR para generar modelos celulares como herramientas de investigación. Nuestro centro cuenta con una amplia experiencia y tecnología para estas tareas, incluyendo lentiCRISPR, perfeccionada mediante numerosos experimentos previos. Los tipos de alteraciones genéticas que podemos generar incluyen alelos nulos (KO) e inserción de un casete reportero (KI), así como la corrección de mutaciones, lo cual puede ser particularmente útil para el desarrollo de células de control isogénicas. Hemos establecido un protocolo eficiente y completo para este tipo de necesidades. Ofrecemos una consulta gratuita al inicio del proyecto. Se enviará por correo electrónico al investigador principal un resumen de los pasos experimentales y el costo asociado antes del inicio del experimento. Posteriormente, el investigador principal recibirá células policlonales modificadas genéticamente o células clonadas individualmente.